胡晓婷万晗曦谢婷婷徐侨翌邢顺鹏皋源何征宇

上海交通大医院重症医学科

国际麻醉学与复苏杂志,,41(03):-.

DOI：10./cma.j.issn.-..03.

基金项目

国家自然科学基金（）；

上海杰出青年医学人才培养资助计划（沪卫计人事16号）

ORIGINALARTICLES

本课题拟观察脂多糖（LPS）诱导肺成纤维细胞有氧糖酵解关键酶6?磷酸果糖?2?激酶/果糖?2,6?二磷酸酶3（PFKFB3）表达及其与肺成纤维细胞有氧糖酵解的关系，以探讨在LPS诱导的肺纤维化过程中LPS诱导肺成纤维细胞和肺组织有氧糖酵解的潜在机制。

1材料与方法

1.1　分组和处理

1.1.1　人胚肺成纤维细胞的培养

人胚肺成纤维细胞MRC?5细胞系购自中国科学院细胞库，用含10%胎牛血清的MEM培养基培养于含5%二氧化碳、充分湿化的37℃恒温孵育箱中。当细胞达到90%融合时，加入2ml0.25%胰酶消化2~3min，并进行传代。将培养状态良好的细胞采用随机数字表法分为2组（每组3个孔）：PBS对照组（PBS组）和LPS组。PBS组加入PBS作为对照,LPS组加入终浓度为1.00mg/L的LPS，于规定时间点收集细胞或细胞培养上清液进行后续实验。

1.1.2　实验动物的分组和处理

6~8周龄雄性野生型C57BL/6小鼠24只，体重（22.0±2.0）g。将24只小鼠按随机数字法分为2组（每组12只）：生理盐水对照组（C组）和LPS组（L组）。首先对小鼠称重，计算每只小鼠应注射LPS的体积（5mg/kg）或生理盐水体积；L组在实验开始后将LPS经腹腔注射入小鼠体内，连续注射5d，C组使用等体积生理盐水作为阴性对照，分别于造模后7d和28d无痛处死小鼠。小鼠麻醉后先进行心脏取血，取血后置于抗凝管中，立即4℃、g离心10min后取上清分装至EP管中冻于?80℃冰箱待测，同时各组留取左肺组织置于4%多聚甲醛固定，右肺叶用冰生理盐水清洗后放入?80℃保存备用。

1.2　Westernblot检测PFKFB3蛋白表达情况

1.2.1　肺成纤维细胞中PFKFB3蛋白表达检测

将肺成纤维细胞以4×个/ml的密度接种于6孔培养板，经LPS或PBS处理6h后，每孔加入μl含有1%PMSF溶剂、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞，4℃、g离心15min，吸取上清，以BCA法测定蛋白浓度。用10%的分离胶进行SDS?PAGE电泳，使用转移电泳装置在4℃恒流mA条件下转膜70min，将蛋白样品转印至PVDF膜。在室温条件下封闭PVDF膜1h，加入含5%牛血清白蛋白（BSA）的吐温20Tris盐酸缓冲液［TBST，Tris盐酸缓冲液（TBS）+0.1%Tween?20，20×TBS，Tween?20］稀释的目的蛋白或内参β?actin的一抗［PFKFB31∶0稀释；β?actin1∶0稀释］，4℃孵育过夜，次日TBST漂洗后加入含5%BSA的TBST稀释的辣根过氧化酶山羊抗兔二抗（1∶0稀释），室温孵育1h，TBST漂洗后在显影仪进行显色反应。显色后使用ImageLab软件对蛋白条带灰度值进行定量分析。以目的蛋白灰度值与β?actin灰度值比值表示目的蛋白的表达水平。

1.2.2　肺组织PFKFB3蛋白表达检测

取处理后7d适量冻存的肺组织，每管加入μlRIPA裂解液，放入研磨仪中，60Hz、60s间断研磨两次至肺组织已完全磨碎，放入预冷的离心机中4℃、g离心15min后取上清，置于新的EP管中，后续蛋白定量及电泳同1.2.1。

1.3　Westernblot检测胶原蛋白表达情况

1.3.1　肺成纤维细胞中Ⅰ型胶原蛋白表达检测

将肺成纤维细胞以3×个/ml的密度接种于6孔培养板，经LPS或PBS处理48h后取各组3孔收集细胞，蛋白提取和电泳方法同1.2.1，mA转膜2h，封闭1h后加入目的蛋白［Ⅰ型胶原蛋白1∶0稀释］和β?actin的一抗，4℃孵育过夜，后续实验同上。

1.3.2　肺组织Ⅰ型胶原蛋白表达检测

取处理后28d适量冻存的肺组织，每管加入μlRIPA裂解液，60Hz、60s间断研磨两次至肺组织已完全磨碎，后续蛋白定量及电泳同1.3.1。

1.4　免疫荧光技术检测PFKFB3蛋白表达

1.4.1　肺成纤维细胞PFKFB3蛋白表达检测

将肺成纤维细胞接种于放置无菌盖玻片的12孔细胞培养板中，密度8×个/ml，经LPS或PBS处理48h后，用4%多聚甲醛固定细胞10min，用0.5%TritonX?穿膜10min，室温封闭1h，加入PFKFB3一抗，4℃过夜，次日PBS洗去一抗，用一抗二抗稀释液稀释的Cy3标记的山羊抗兔二抗避光室温孵育1h，然后用含有4,6?二脒基?2?苯基吲哚（DAPI）核染料的封片剂进行封片。置于荧光显微镜下观察、拍照，此过程注意避光。

1.4.2　肺组织PFKFB3蛋白表达检测

左肺组织经过4%多聚甲醛固定后，转移至30%蔗糖脱水2d，然后进行石蜡包埋，包埋后的组织块固定在?20℃恒温切片机，连续切片，切成4μm厚度切片。切片甩干后用组化笔在组织周围画圈防止抗体流失，在圈内滴加免疫染色封闭液室温封闭1h；轻轻甩掉封闭液，置于PBS中在摇床上洗涤3次。切片稍甩干后，在圈内滴加用免疫染色一抗二抗稀释液稀释的目的蛋白的一抗［PFKFB31∶稀释］，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜，后续步骤同1.1.2。

1.5　Seahorse细胞能量代谢仪检测细胞有氧糖酵解

将肺成纤维细胞以1×个/ml的密度接种于专用的96孔细胞培养板，每孔加入80μl完全培养基，经LPS或PBS处理48h后按照安捷伦公司的实验步骤进行后续操作。

1.6　比色法检测乳酸（LD）的含量

1.6.1　细胞培养上清液LD含量检测

将细胞以3×个/ml的密度接种于6孔板中，于PBS或LPS刺激48h后，收集细胞并培养上清液，4℃、g离心5min后取上清液置于EP管中冻于?80℃备用。使用LD测试盒

通过比色法对样本进行检测，具体操作步骤根据试剂盒说明书进行。

1.6.2　小鼠血浆LD含量检测

取处理后7d冻存的小鼠血浆，实验步骤同1.6.1。

1.7　肺组织病理学检测

取处理后28d肺组织，多聚甲醛固定后，石蜡包埋切片并经H?E染色、马松（Masson）染色和α?SMA免疫组织化学染色后显微镜下观察各组肺组织炎症浸润和纤维化情况。

2结果

2.1　肺成纤维细胞PFKFB3蛋白表达情况

PFKFB3蛋白表达结果显示，LPS刺激肺成纤维细胞6h后，与PBS组比较，LPS组PFKFB3表达明显升高（P0.05，图1）；同时免疫荧光结果显示，LPS组PFKFB3表达较PBS组增加（图2）。

2.2　肺成纤维细胞有氧糖酵解水平

LPS刺激肺成纤维细胞48h后，与PBS组比较，LPS组细胞耗氧率降低，产酸率增加，提示细胞从氧化磷酸化向糖酵解转变（图3）。

2.3　细胞培养上清液LD的表达情况

LPS刺激肺成纤维细胞48h后，与PBS组比较，LPS组细胞培养上清LD含量明显升高，差异有统计学意义（P0.05，图4）。

2.4　肺成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白表达情况

Ⅰ型胶原蛋白表达结果显示，LPS刺激肺成纤维细胞48h后，与PBS组比较，LPS组Ⅰ型胶原蛋白表达明显升高（P0.05，图5）。

2.5　小鼠肺组织PFKFB3蛋白表达情况

PFKFB3蛋白表达结果显示，与C组比较，L组PFKFB3蛋白表达明显升高，差异有统计学意义（P0.05，图6）；同时免疫荧光结果显示，L组PFKFB3表达较C组增加（图7）。

2.6　小鼠血浆LD的表达情况

以比色法检测LPS腹腔注射小鼠后其血浆LD变化情况发现：L组血浆LD含量较C组明显增高，差异有统计学意义（P0.05，图8）。

2.7　肺组织Ⅰ型胶原蛋白表达情况

Ⅰ型胶原蛋白表达结果显示，与C组比较，L组Ⅰ型胶原蛋白表达明显升高，差异有统计学意义（P0.05，图9）。

2.8　肺组织病理学观察

与C组比较，H?E染色下L组小鼠肺泡完整性破坏，肺泡壁增厚，大量中性粒细胞浸润。Masson染色示L组小鼠肺组织纤维化明显增加。α?SMA免疫组化染色示L组小鼠肺成纤维细胞大量活化为肌成纤维细胞（图10）。

3讨论

在本研究中，本课题组在细胞和动物水平证实在LPS诱导的肺纤维化过程中，LPS可以诱导肺成纤维细胞表达PFKFB3，在时间上早于肺成纤维细胞有氧糖酵解的启动，提示PFKFB3的表达可能是LPS诱导肺成纤维细胞有氧糖酵解的关键环节。本研究仅观察性探究了LPS对肺成纤维细胞PFKFB3蛋白表达及有氧糖酵解启动的关系，今后的研究尚需对PFKFB3的表达进行干预后观察LPS刺激有氧糖酵解的变化情况，以全面评价PFKFB3在LPS诱导肺成纤维细胞有氧糖酵解过程中的重要作用，同时进一步明确其与肺纤维化之间的关系。

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