万晗曦　谢婷婷　徐侨翌　胡晓婷　邢顺鹏　皋源　何征宇

，上海交通大医院重症医学科（万晗曦、谢婷婷、徐侨翌、胡晓婷、邢顺鹏、皋源、何征宇）

国际麻醉学与复苏杂志,,39(10):-.

DOI：10./cma.j.issn.-..10.

基金项目

国家自然科学基金（）

ORIGINALARTICLES

本课题通过不同浓度LPS刺激原代培养小鼠肺成纤维细胞，比较细胞Thy-1和整合素β3蛋白的表达情况、自噬相关蛋白LC3和Beclin-1的表达情况以及自噬小体形成情况，以明确LPS对肺成纤维细胞Thy-1和整合素β3蛋白表达的调控作用，并观察其与细胞自噬抑制的关系。

1　材料与方法

1.1　小鼠肺成纤维细胞的原代培养

雄性野生型C57BL/6小鼠6只，8周龄，体重（20.0±2.0）g。无菌状态下迅速取肺脏，PBS漂洗后放于新的10cm培养皿，剪去血管等组织，剪碎肺组织，加入14ml含10%胎牛血清的高糖培养基，培养基中加入IU/ml青霉素和IU/ml链霉素，再加入1ml单位Ⅰ型胶原酶。将10cm培养皿放入37℃恒温摇床，r/min30min后，将培养基移入50ml离心管，0r/min室温离心10min（离心半径12cm），弃上清，将沉淀重悬装入10cm培养皿，置于含5%二氧化碳、充分湿化的37℃恒温孵育箱中培养，30min后弃培养基换新的完全培养基，之后每2~3天换液1次。当细胞达到大约90%融合时，加入1ml0.25%胰酶消化2~3min，并按1∶3比例传代。细胞经3代培养后呈典型梭形，经免疫细胞化学鉴定胞浆中波形蛋白、角蛋白阳性，证实为成纤维细胞，可用于实验。

1.2　Westernblot检测Thy-1与整合素β3的蛋白表达

1.2.1　实验分组及处理

将原代培养的小鼠肺成纤维细胞以4×个/ml的密度接种于6孔培养板，每孔加入2ml完全培养基，培养12h，待细胞贴壁并达到70%融合后，更换培养基为无血清培养基饥饿过夜，之后采用随机数字法将其分为4组（每组3孔）：PBS对照组（Con组）、0.25mg/LLPS组（LPS0.25组）、0.50mg/LLPS组（LPS0.50组）、1.00mg/LLPS组（LPS1.00组）。Con组加入PBS作为对照；LPS0.25组、LPS0.50组和LPS1.00组分别加入终浓度为0.25、0.50、1.00mg/L的LPS。经LPS或PBS处理后6h，取各组3孔收集细胞，用于下述指标的测定。

1.2.2　肺成纤维细胞中Thy-1与整合素β3蛋白表达检测

从培养箱取出6孔板，弃去培养基，以PBS洗去细胞碎片及培养基，将6孔板置于冰上，每孔加入80μl含有1%PMSF溶剂、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，用预冷的细胞刮将细胞轻轻刮下，冰上裂解细胞10~15min后，将样品分别转移至Ep管中，4℃，g，离心15min后取上清，以BCA法测定蛋白浓度，根据样本体积加入相应体积的5×loadingbuffer上样缓冲液，振荡器混匀后，℃煮沸10min。根据所测蛋白浓度计算30μg样品所需的上样体积，选用浓度为10%的分离胶进行SDS-PAGE电泳，使用转移电泳装置在4℃，恒流mA条件下转膜min，将蛋白样品转移到PVDF膜上。用TBST（TBS+0.1%Tween20）加5%脱脂奶粉配成的封闭液室温封闭PVDF膜1h，TBST冲洗后加入用含5%牛血清白蛋白（BSA）的TBST稀释的目的蛋白或内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的一抗4℃孵育过夜，TBST冲洗PVDF膜后加入辣根过氧化物酶山羊抗兔、抗小鼠二抗，室温孵育1h，TBST冲洗PVDF膜后，在显影仪上进行显色反应。显色后，使用ImageLab和ImageJ软件对蛋白条带的灰度值进行定量分析。

1.3　Westernblot检测自噬相关蛋白LC3和Beclin-1的表达情况

1.3.1　实验分组及处理

原代培养的小鼠肺成纤维细胞接以4×个/ml的密度种于6孔板，按随机数字法分为两组：PBS对照组（Con组）和1.00mg/LLPS组（LPS1.00组）。PBS或LPS刺激细胞30h后进行后续实验，其余处理同上。

1.3.2　肺成纤维细胞中LC3和Beclin-1蛋白表达检测

蛋白提取及电泳同1.2.2，mA转膜65min，封闭1h后，TBST冲洗后加入目的蛋白或内参GAPDH的一抗4℃孵育过夜，后续实验同上。

1.4　透射电子显微镜观察自噬小体

实验分组及处理同1.3.1。①取材：收集两组细胞于离心管中，~0r/min离心10min（离心半径12cm），弃上清，弹指法混匀细胞。沿管壁加入2.0％~2.5％冷戊二醛，轻轻吹打，4℃固定30min。4℃PBS缓冲液冲洗1~2h或过夜，随后0r/min离心5min（离心半径12cm），弃上清。②制备预包埋块：管内加入2％~4％37℃琼脂糖液0.1~0.5ml，两手搓离心管，使细胞与琼脂糖混匀，室温冷却，形成细胞琼脂凝胶预包埋块。离心管内加适量PBS缓冲液或75%乙醇溶液，铝片沿管壁轻轻地将细胞琼脂糖凝胶块分离，预包埋块移入含75％乙醇溶液的容器内，24h后换固定液一次，4℃保存。③固定：预包埋块切成1mm3大小，置于1%锇酸4℃固定1~2h。④漂洗与脱水：PBS缓冲液漂洗30min或过夜。分别用50％、70％、90％、％丙酮脱水各1次，每次10~15min；％丙酮脱水3次，每次30min。⑤浸透、包埋与聚合：浸入稀释包埋剂（丙酮：包埋剂为1∶1）中，室温1h。再浸入纯包埋剂（如环氧树脂）中，37℃过夜。60℃固化48h。⑥超薄切片：首先将标本包埋块顶端修成近45°的四边锥体，使标本暴露出来，切面呈长宽约为0.4~0.6mm的长方形或梯形。然后将其夹在标本夹中，固定在切片机上。玻璃切片刀需用胶布围成水槽，加入适量蒸馏水，使切下的薄片漂在水面，用覆有支持膜（透明塑胶膜）的载网（铜网或镍网）收集。⑦染色：在平皿中放一片蜡纸，并在其上滴1滴乙酸铀染液，用弯头小镊子夹住载网边缘，把贴有薄片的一面朝下，轻轻插入染液中，盖上平皿盖，室温下染色10~20min，双蒸水清洗2次；置入枸橼酸铅染液中染色15min，0.1mol/L氢氧化钠染液漂洗1~2s，双蒸水清洗2次。⑧观察：切片自然干燥后观察。

2　结　果

2.1　Thy-1与整合素β3蛋白表达情况

Thy-1蛋白表达结果显示，随着LPS刺激浓度的增加，Thy-1蛋白表达量下调，Thy-1蛋白表达量Con组最高，随后随LPS刺激浓度的升高逐渐降低，LPS1.00组较Con组明显降低，差异有统计学意义（P0.05，图1）；整合素β3蛋白表达结果显示，随着LPS刺激浓度的增加，整合素β3蛋白表达量上调，整合素β3蛋白表达量Con组最低，随后随LPS刺激浓度的升高逐渐增高，LPS1.00组较Con组明显增高，差异有统计学意义（P0.05，图2）。

2.2　噬相关蛋白LC3和Beclin-1的蛋白表达情况

LC3蛋白结果显示，LPS1.00组刺激小鼠肺成纤维细胞后，（LC3Ⅱ/LC3Ⅰ）LC3Ⅱ/Ⅰ明显下降，差异有统计学意义（P0.05）。Beclin-1蛋白结果显示，LPS1.00组刺激小鼠肺成纤维细胞后，Beclin-1明显下降，差异有统计学意义（P0.05，图3）。

2.3自噬小体

Con组细胞核、膜清晰完整，染色质呈细颗粒状，可见大量双层膜或多层膜结构（即自噬小体），包裹的吞噬物为降解的细胞质或细胞器，LPS1.00组自噬小体较Con组明显减少，每组随机取5个视野进行统计后发现，LPS1.00组自噬小体较Con组明显减少，差异有统计学意义（P0.05，图4）。

3　讨　论

本研究在细胞水平证实，LPS可下调Thy-1的蛋白表达、上调整合素β3蛋白表达，同时抑制自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin-1的表达及自噬小体的生成。

Thy-1是成纤维细胞表面由糖磷脂酰肌醇锚定的糖蛋白。正常肺组织中肺成纤维细胞存在Thy-1的适度表达，而肺纤维化组织中存在大量Thy-1表达缺失并异常增殖的肺成纤维细胞（即Thy-1细胞），Schmidt等在正常皮肤真皮细胞中发现Thy-1能与整合素αvβ3结合，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，而Thy-1基因表达缺失能引起细胞的异常增殖。整合素是一种表达于细胞表面的重要黏附分子，由不同的α和β亚基结合而构成不同亚型，其配体为细胞外基质成分。整合素通过与胞外基质中的相应配体结合能活化Src家族激酶及PI3K-Akt等下游信号转导通路，介导细胞增殖、凋亡过程而参与细胞周期的调控并参与肺纤维化的形成。已经有大量研究证实磷脂酰肌醇3-激酶通路的活化可抑制肺成纤维细胞的自噬和肺纤维化过程。

目前已经证实在Thy-1+的正常肺成纤维细胞中，Thy-1能与整合素αvβ5相互作用而抑制胶原蛋白诱导的细胞活化过程，而Fiore等的研究进一步发现正常Thy-1+的肺成纤维细胞中，Thy-1与整合素αvβ3结合能使整合素αvβ3肽链胞外区中包含配体（即细胞外基质蛋白）结合部位的“头端”向细胞浆膜面呈“V”字形弯曲，从而掩盖了配体的活化位点，呈现不易与细胞外基质蛋白结合的“非活化”状态，而Thy-1表达缺失能使整合素αvβ3呈非结合状态而发生分子构象改变，即整合素αvβ3肽链“头端”在细胞浆膜面外伸直并相互聚集，表现为易于结合细胞外基质蛋白配体的“活化”状态，通过活化Src家族激酶的c-Src而诱导肺成纤维细胞分化，提示Thy-1与整合素αvβ3的结合能通过改变整合素分子构象而改变整合素的活化状态，并进而影响肺成纤维细胞的细胞生物学行为。但该研究尚未明确整合素αvβ3的活化状态是否影响了肺成纤维细胞的自噬水平。而Zhu等发现整合素β3的活化能通过Akt的活化而抑制心肌细胞的自噬过程，提示整合素的活化状态可能影响细胞的自噬过程。

本课题组前期研究发现LPS刺激小鼠肺成纤维细胞48h后能明显抑制Thy-1mRNA转录，而此次研究发现LPS刺激小鼠肺成纤维细胞6h即能明显抑制Thy-1蛋白的表达，同时整合素β3的表达也明显上调；LPS刺激小鼠肺成纤维细胞30h后自噬相关蛋白Beclin-1和LC3的表达明显下降，透射电子显微镜发现LPS刺激小鼠肺成纤维细胞30h后自噬小体明显减少，对此我们猜测，LPS可能是通过影响Thy-1与整合素β3的表达及相互作用抑制肺成纤维细胞自噬，从而引发肺纤维化。

本次研究仅仅观察性探究了LPS对肺成纤维细胞Thy-1及整合素β3的蛋白表达水平研究，以及LPS对肺成纤维细胞的自噬影响，并没有深入研究Thy-1与整合素β3是通过何种途径相互作用，同时观察后续抑制自噬的可能机制。在今后的研究中，有必要在细胞及动物水平通过对Thy-1以及整合素β3表达的干预进一步明确两者与细胞自噬以及肺纤维化之间的关系。

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